Le spectrophotomètre est un équipement utilisé en laboratoire pour déterminer la concentration d’une substance dans une solution, permettant ainsi d’effectuer une analyse quantitative. Les spectrophotomètres sont des outils essentiels dans de nombreux domaines scientifiques, comme la chimie, la biologie et la recherche environnementale, où des mesures précises et exactes de l'absorption de la lumière sont nécessaires.
Il est essentiel de mener des processus d'étalonnage et de validation approfondis pour préserver la fiabilité des données spectrophotométriques. L’utilisation d’un spectrophotomètre est courant dans des laboratoires scientifiques, notamment en chimie, biologie et en analyse environnementale.
Pourquoi l’étalonnage et la validation des spectrophotomètres sont-ils importants?
L'étalonnage prend en compte la quantification des erreurs et l’incertitude de l’échelle photométrique et de l’échelle de longueur d’onde qui servent de base pour connaître l’état dans lequel il se trouve par rapport aux spécifications du fabricant, à la classe de précision ou aux erreurs maximales tolérées de l’équipement.
Le processus d’étalonnage, selon les instructions d’utilisation, doit être effectué au maximum tous les 14 jours. Notre recommandation est de l’effectuer quotidiennement, car l’investissement en temps par rapport à ses performances est minime.
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Étalonnage de la longueur d'onde: L'étalonnage de la longueur d'onde est essentiel pour garantir que le spectrophotomètre identifie et mesure de manière fiable les longueurs d'onde lumineuses souhaitées.
Étalonnage photométrique: L'étalonnage photométrique se concentre sur la précision de la réponse de l'instrument à différents niveaux d'intensité lumineuse. L'étalonnage est généralement réalisé à l'aide de filtres à densité neutre ou de solutions étalons avec des valeurs d'absorption connues.
Correction de la lumière parasite: Les spectrophotomètres peuvent être exposés à une lumière parasite, qui peut interférer avec la précision des mesures. L'étalonnage consiste à corriger la lumière parasite en utilisant une solution vierge (sans analyte) et une solution à forte absorbance.
Étalonnage de la ligne de base: L'étalonnage du spectrophotomètre est nécessaire pour obtenir des mesures précises de la ligne de base ou de l'absorbance de départ.
L'étalonnage est un processus continu qui comprend des inspections de maintenance régulières.
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Le processus de validation commence par une évaluation des performances globales du spectrophotomètre. L'efficacité de l'étalonnage est vérifiée dans le cadre de la procédure de validation.
Tests de reproductibilité: Les tests de reproductibilité évaluent la capacité du spectrophotomètre à produire des résultats cohérents lors de la mesure répétée du même échantillon.
Tests d'adéquation du système: Des tests d'adéquation du système sont effectués pour évaluer les performances globales du système analytique, y compris du spectrophotomètre.
La validation du spectrophotomètre comprend la validation de méthodes d'analyse spécifiques. La validation repose en grande partie sur l'intégrité des données.
Le dosage par étalonnage est une méthode géniale en chimie pour mesurer la concentration d'une substance dans un échantillon. On crée une courbe en utilisant des concentrations connues, puis on l'utilise pour estimer la concentration de la substance dans un échantillon inconnu. C'est comme résoudre un casse-tête scientifique !
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Le dosage par étalonnage repose sur l’utilisation de solutions (appelées "solutions étalons") qui contiennent l’espèce chimique à doser en différentes concentrations connues. Il suppose également que la concentration de l’espèce chimique influe sur une grandeur physique (comme l'absorbance, la conductivité...) qu’il est possible de mesurer. On compare ensuite les propriétés physiques de l’échantillon à la même propriété physique pour une gamme étalon.
Pour réaliser un dosage par étalonnage, il faut reporter sur un graphique des points dont l’abscisse correspond à la concentration des solutions connues et l’ordonnée correspond à la grandeur physique mesurée. On obtient alors une courbe appelée courbe d’étalonnage. Il suffit alors de mesurer la grandeur physique de la solution à doser afin d’obtenir un point de la courbe dont l’abscisse indique la concentration recherchée.
Avantages:
Inconvénients:
Les principales techniques utilisées pour réaliser un dosage par étalonnage sont la spectrophotométrie et la conductimétrie.
Le spectrophotomètre permet de mesurer la quantité de lumière absorbée. Quand la lumière passe à travers une solution colorée, celle-ci est absorbée par le ou les solutés. On parle d’absorbance ou encore de densité optique. La spectrophotométrie permet ainsi d’étudier d’absorbance de solutions dans l’infrarouge, le visible et dans l’ultraviolet.
On mesure l’absorbance (A) grâce à un spectrophotomètre. Celui-ci mesure l’absorbance (A) d’une solution pour une longueur d’onde donnée. Le spectrophotomètre est composé d’une source de lumière et d’une fente qui permet d’isoler un faisceau quasi monochromatique (pour ne sélectionner qu’une seule longueur d’onde). Dans une cuve, on introduit la solution à tester. Un détecteur placé après la cuve permet de détecter les intensités lumineuses avant et après le passage du faisceau.
L'absorbance varie en fonction de la concentration en suivant la loi de Beer-Lambert: Avec ε = absorbance appelée aussi coefficient d’extinction spécifique, l = longueur de la cuve, c la concentration en solution. Cette formule indique une relation linéaire entre l’absorbance et la concentration ce qui implique que la courbe d’étalonnage est une droite et peut donc être tracée avec un nombre limité de points.
Protocole: Avant toute chose, on étalonne le spectrophotomètre en utilisant une solution de solvant pour régler le « zéro ». (Cette solution s’appelle un blanc). On utilise une solution mère colorée (par exemple de la teinture d’iode). On effectue ensuite une série de dilution et on note l’absorbance indiquée pour chaque solution fille.
Ce sont les ions présents dans l'eau qui la rendent conductrice. Quand une solution contient des ions, elle conduit l’électricité. Dans le cas contraire, on dirait que la solution est isolante. Une solution ionique, appelée électrolyte, est conductrice d’électricité à cause de la présence d’ions.
La conductance ou conductivité est mesurée à l’aide d’un conductimètre. Le conductimètre est un capteur qui permet de mesurer la conductivité d’une solution entre deux électrodes. La conductivité d’une solution est notée σ et s’exprime en Siemens par mètre.
La loi de Kohlraush établit la relation entre la concentration d’une solution et la conductivité. Ainsi pour une solution diluée, la conductivité d’un électrolyte σ est proportionnelle à sa concentration. Il s’agit d’une relation linéaire qui aboutit à une courbe d’étalonnage correspondant à une droite.
Les performances d'un spectrophotomètre UV/Vis dépendent du bon fonctionnement du dispositif optique interne, qui peut être vérifié en évaluant divers paramètres. Les pharmacopées définissent les exigences de performances des spectrophotomètres UV/Vis et les procédures requises pour les vérifier. Le but est de garantir la précision et la fiabilité des résultats obtenus.
Les spectrophotomètres UV/Vis Excellence sont testés conformément aux procédures définies dans la pharmacopée américaine (USP) et la pharmacopée européenne (Ph. Eur.). Les tests portent sur les paramètres suivants :
D'autres paramètres, non stipulés par l'USP et la Ph. Eur. sont également testés :
En mettant en œuvre ces techniques, l'étalonnage établit un point de référence cohérent, tandis que la validation vérifie les performances de l'instrument dans divers contextes. La combinaison de techniques rigoureuses d'étalonnage et de validation améliore non seulement la qualité des données scientifiques, mais fait également progresser les connaissances dans de multiples disciplines scientifiques.
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