Les milieux de culture sont essentiels pour répondre aux exigences des laboratoires de microbiologie. Formulés selon les normes internationales (ISO, Pharmacopée, etc.) et accrédités ISO11133 pour le secteur agroalimentaire ainsi que ISO 4973 pour les applications cosmétiques, ces milieux garantissent performance, reproductibilité et facilité d’utilisation. Qu’il s’agisse d’enrichissement, d’isolement ou de dénombrement des micro-organismes, des solutions déshydratées ou prêtes à l’emploi sont disponibles, adaptées à tous les besoins.
Les milieux déshydratés offrent une solution économique, durable et personnalisable. Grâce à leur longue durée de conservation et à leur format compact, ils permettent une gestion optimisée des stocks. Faciles à reconstituer, ils offrent une grande flexibilité dans la préparation des volumes nécessaires au quotidien.
ABE (Advanced Bioengineering) accompagne les laboratoires avec des formulations et des conditionnements sur mesure, adaptés aux contraintes techniques, réglementaires ou logistiques, car chaque application microbiologique peut exiger un milieu spécifique.
La coproculture est une étape de l’examen microbiologique des selles, qui vise à détecter les porteurs sains de bactéries entéropathogènes. Cet examen a longtemps été pratiqué systématiquement pour le personnel des services de restauration et de l’industrie agro-alimentaire. Il permet également de surveiller les flores de certains sujets immunodéprimés comme les patients aplasiques des services d’onco-hématologie.
En raison de leur pathologie, ces patients subissent une décontamination digestive afin de réduire quantitativement une partie de leur flore intestinale. Pour des raisons d’efficacité et de coût, le laboratoire ne recherche pas systématiquement la totalité des agents susceptibles d’être entéropathogènes.
Le prélèvement s’effectue de préférence au laboratoire. Afin d’éviter la dessiccation et la prolifération des bactéries et levures commensales, il faut analyser les selles dans les 2 heures qui suivent leur recueil. Au-delà de ce délai, un système de transport comme le dispositif COPAN fecal swab est nécessaire.
Voici les étapes clés de l'analyse des selles :
La coproculture correspond à l’ensemencement de milieux généralement sélectifs pour isoler puis identifier l’agent infectieux. La recherche de microorganismes entéropathogènes par PCR multiplex est en plein essor. Les laboratoires qui utilisent ces méthodes ont considérablement réduit le nombre de selles mises en culture. En effet la mise en culture se limitent aux selles pour lesquelles les tests moléculaires sont positifs.
Compte tenu que les Salmonella sont souvent en petite quantité dans les selles, on ensemence dès le premier jour, un milieu d’enrichissement. Ces milieux sélectifs inhibent totalement la culture des Gram + et partiellement celle des Gram -.
Les milieux de culture sélectifs jouent un rôle crucial dans l'isolement et l'identification des bactéries pathogènes. Ils contiennent des inhibiteurs qui empêchent la croissance de certaines bactéries, facilitant ainsi la détection des espèces recherchées.
La novobiocine et la cefsulodine, présentées sous forme d’un supplément lyophilisé (SR0194), sont ajoutées au milieu afin d’inhiber la croissance de la flore compétitrice comme Proteus spp. Pseudomonas (mais ils sont oxydase +), Providencia, Morganella morganii, certains biotypes d’E.
Les colonies suspectes d’être des Salmonella sont des colonies rouges pour Rambach et mauve à rose pâle pour SMID2. Enfin si l’identification est faite par spectrométrie de masse MALDI-TOF, il est possible, étant donné la rapidité du résultat, de tester une nouvelle colonie si la première n’est pas une Salmonella.
Ce test, peu onéreux et rapide, permet d’éliminer les Proteus (les Salmonella et Shigella sont uréase - et les Proteus sont uréase +). Les tubes sont placés à l’étuve à 37°C avec un témoin Proteus. En toute rigueur, il convient de poursuivre l’identification des seules colonies vérifiées « uréase négative ». La galerie API 20E sera, par exemple, ensemencée après avoir ajouté 4 mL d’eau distillée stérile à une suspension uréase négative.
Les Campylobacter doivent être recherchés systématiquement en cas de diarrhée, au même titre que les Salmonella. C. jejuni se reconnaît par sa morphologie et sa mobilité caractéristique en « vol de moucheron ».
Il semble avantageux d’associer ces deux techniques. La technique de filtration semble dans la réalité, très peu utilisée. Le milieu de base est un milieu nutritif riche type Mueller Hinton ou Columbia. On réalise une suspension épaisse de la selle dans un bouillon Brucella agar. La filtration dure une heure à 37°C.
Les Campylobacter sont microaérophiles. C. jejuni et C. coli se développent à 37°C et à 42°C (espèces thermophiles). La sélection des espèces C. jejuni et C. coli coli sur ces milieux est donc favorisée par une incubation à 42°C.
Pour l'identification, on utilise un milieu Mueller Hinton au sang ensemencé avec une solution d’opacité équivalente à l’étalon 0.5 de Mac Farland et sur lequel on dépose un disque de céfalotine et un disque d’acide nalidixique. L’hippuricase est caractéristique de l’espèce C. jejuni. Un test immunochromatographique unitaire : Immunocard Stat !
Les Yersinia ont la particularité se développer plus lentement que les autres entérobactéries et d’avoir une température optimale de croissance inférieure (28°C au lieu de 37°C). Dans un produit polymicrobien comme les selles et dans les conditions de culture classiques (24h à 37°C), ces bactéries sont le plus souvent masquées par la flore digestive. L’enrichissement en Yersinia est rarement pratiqué. Sa sélectivité élevée permet d’inhiber la presque totalité de la flore associée (désoxycholate, cristal violet, irgasan, cefsulodine et novobiocine). La présence de mannitol et de rouge neutre facilite le repérage des colonies et permet une orientation présomptive de Y. Ce milieu ne permet cependant pas la croissance de toutes les Yersinia entéropathogènes, et de plus il inhibe certaines souches de Y. Après 24 h d’incubation, les colonies de Yersinia apparaissent petites (1 mm de diamètre) translucides à centre rouge ou entièrement rouges (mannitol +). L’intérêt d’un test uréase rapide est discutable. La galerie est ensemencée directement avec les colonies suspectes. Si une souche de Yersinia enterocolitica est identifiée, il faut l’envoyer au CNR afin que soit réalisé un biotypage, un sérotypage et un lysotypage.
Les selles diluées sont ensemencées sur milieu BCP (ce milieu non sélectif permettra d’apprécier l’abondance des colonies suspectes par rapport à la flore commensale). Le lendemain, on recherche les colonies suspectes qui sont des colonies lactose +, en grand nombre, puis on vérifie ensuite que ces colonies suspectes sont bien des E. Les souches d’Escherichia coli O157 se différencient des autres E. Un des premiers milieux mis au point pour leur isolement est la gélose SMAC : une gélose Mac Conkey dont le lactose est remplacé par du sorbitol. Identifier l’espèce E. la recherche des gènes stx1 et stx2 après amplification génique à partir des selles ou d’une culture de 24h. Ces tests ont pour avantage de permettre l’identification des EHEC non O157 H7.
En France, on recherche Vibrio cholerae chez les malades présentant une diarrhée au retour d’un voyage en Afrique, Asie ou Amérique latine. Les selles des patients atteints de choléra sont fécaloïdes pendant les premières heures de la maladie puis liquides et dans les cas extrêmes aqueuses avec des grains riziformes. V. Chez les sujets porteurs sains ou présentant une forme atténuée de choléra, les Vibrio cholerae sont présents en petite quantité dans les selles. Il est dès lors nécessaire d’enrichir les selles en V. cholerae. L’enrichissement s’obtient en ensemençant une eau peptonée salée alcaline (pH=9). Il est important de déterminer rapidement si les colonies suspectes sont celles de l’agent du choléra (donc d’une souche de V. cholerae O1 ou O139) afin d’alerter immédiatement les autorités sanitaires.
Remarque : la galerie API 20E comprend davantage de caractères utiles à l’identification des Vibrio, elle est préférable à la galerie API20NE. 1 Eau Peptonée Salée Alcaline. Un 2ème enrichissement est souhaitable. Les Vibrio non cholerae sont responsables d’infections intestinales appartiennent aux espèces V. parahaemolyticus, V. fluvialis, V. mimicus, V. holisae. Le protocole de leur recherche est semblable à celui de Vibrio cholerae, sauf que l’analyse est poursuivie sur toutes colonies de plus de 2 mm de diamètre obtenue sur TCBS (Saccharose + ou Saccharose -).
Les Aeromonas responsables de diarrhées appartiennent aux espèces A. hydrophila et A. veronii. Ils se développent bien sur le milieu Hektoen, mais donnent des colonies semblables aux E. coli commensaux. Pour faciliter leur repérage, on peut ensemencer une gélose au sang de mouton + ampicilline à 20 µg/mL. L’oxydase est positive et ils résistent au composé vibriostatique O129. Proteus shigelloides (anciennement nommé Plesiomonas shigelloides) cultive aussi sur Hektoen (colonies vertes plus larges que celles de Shigella). Le test oxydase est positif (exceptionnel pour une entérobactérie).
On recherche C. difficile chez les malades présentant une diarrhée aigüe qui survient au cours d’une antibiothérapie ou dans les 2 mois suivants l’arrêt de celle-ci. Il est inutile de rechercher C. difficile chez les patients asymptomatiques, car ces patients ne sont pas considérés comme contagieux.
Le diagnostic de présomption d’infection à Clostridium difficile (ICD) repose sur la détection dans les selles d’une enzyme spécifique de Clostridium difficile : la GDH.
Le milieu CCFA contient deux antibiotiques (Cyclosérine et Céfoxitine) ainsi qu’un glucide (le fructose) et de l’agar. On additionne à ce milieu du jaune d’œuf ou du sang de cheval. difficile, qui permet de repérer rapidement les colonies de Clostridium difficile. (cf. À partir de colonies isolées de C. difficile, on prépare une suspension dense en prenant soin de prélever plusieurs colonies ; en effet il n’est pas rare de retrouver dans une même selle des souches toxinogènes et non toxinogènes.
Sur milieux lactosés comme la gélose BCP ou la gélose Drigalski, les colonies de K. Fig.
C. perfringens est à l’origine de toxi-infections alimentaires. Il semblerait que les souches productrices d’entérotoxines soient aussi à l’origine de diarrhées post-antibiotiques. L’isolement de C. L’entérotoxine peut être détectée, à partir d’une culture sporulée de C. perfringens, par son effet cytopathogène sur culture cellulaire, ou par des tests immunologiques.
Une étude a montré que la plupart des souches de S. aureus isolées de diarrhées post-antibiotiques étaient des SARM (S. Il est possible d’identifier Staphylococcus aureus avec un test de coagglutination.
Le rôle des Candida dans la survenue de diarrhées post-antibiotiques reste incertain et controversé. On recherche les Candida lorsque l’examen direct montre la présence de filaments mycéliens ou de levures.
On réserve cette recherche aux cas de diarrhées sévères ayant justifié une hospitalisation notamment chez le nourrisson. La microscopie électronique est la technique de référence. Mais l’équipement nécessaire et son manque de sensibilité font que ce n’est pas une technique applicable en routine. Des réactifs commerciaux sont disponibles pour détecter les antigènes viraux par une méthode ELISA. Ces techniques présentent une bonne spécificité mais sont cependant moins sensibles que la détection génomique par RT-PCR (reverse transcription-polymerase chain reaction).
La recherche des parasites se justifie en fonction du contexte clinique et surtout épidémiologique. Pour observer des trophozoïtes mobiles, il est indispensable d’examiner les selles immédiatement.
L’élimination des différentes formes de parasites étant discontinue, le résultat isolé d’un EPS négatif n’a pas de valeur. Il ne permet pas de conclure à l’absence de parasites. Sur selles molles, pâteuses on cherche la présence de kystes abondants et facile à reconnaître : ovoïdes, de 12 x 8µm, avec des flagelles disposés en S. L’observation à l’état frais ou sur frottis après coloration au trichrome permet, en observant les formes végétatives ou de kystes, de différencier Entamoeba histolytica des classiques Endolimax nanus ou Entamoeba coli. La distinction entre les espèces Entamoeba histolytica et Entamoeba dispar est beaucoup plus difficile et seule la mise en évidence de formes végétatives contenant des hématies permet d’identifier Entamoeba histolytica (fig 42). En effet, les kystes de ces deux espèces présentent la même morphologie (fig 43).
Voici une liste de milieux de culture couramment utilisés en microbiologie :
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